Nascido em Fuenllana, Espanha, em 1488, Tomás passou a sua infância em Villanueva de los Infantes, de onde deriva o seu apelido. Os seus pais, um moleiro, eram conhecidos pelos seus actos de caridade, o que influenciou profundamente Tomás desde tenra idade. Prosseguiu os estudos superiores na Universidade de Alcalá, onde se destacou, licenciando-se em Teologia e tornando-se um popular professor de filosofia, artes e lógica. Apesar do seu sucesso académico, recusou uma prestigiada cátedra na Universidade de Salamanca, optando por se juntar aos frades agostinhos em Salamanca em 1516, professando os seus votos em 1517 e sendo ordenado sacerdote em 1518.

Foi fundamental para o envio dos primeiros missionários agostinianos para o Novo Mundo, nomeadamente para o México, em 1533, promovendo os estudos e as missões no seio da Ordem. Em 1544, depois de ter recusado inicialmente o arcebispado de Granada, Tomás foi nomeado arcebispo de Valência. Aceitou o cargo com relutância em 1545.

Estabeleceu programas em que os fundos dos ricos apoiavam os pobres e transformou a sua própria casa num refeitório e num abrigo, alimentando centenas de pessoas diariamente.

Tomás morreu a 8 de setembro de 1555, em Valência, aos 67 anos, depois de sofrer de angina. Foi canonizado pelo Papa Alexandre VII a 1 de novembro de 1658. A sua festa litúrgica celebra-se a 22 de setembro. São Tomás de Vilanova é o santo padroeiro da Universidade de Vilanova, na Pensilvânia, entre outras instituições de ensino e paróquias baptizadas em sua honra.