Thomas werd in 1488 geboren in Fuenllana, Spanje. Hij bracht zijn jeugd door in Villanueva de los Infantes, waar hij zijn achternaam aan ontleende. Zijn ouders, een molenaar, stonden bekend om hun liefdadigheid, wat Thomas al op jonge leeftijd diep beïnvloedde. Hij volgde een hogere opleiding aan de Universiteit van Alcalá, waar hij uitblonk. Hij behaalde een graad in de theologie en werd een populaire professor in de filosofie, kunst en logica. Ondanks zijn academische successen weigerde hij een prestigieus professoraat aan de Universiteit van Salamanca. In plaats daarvan koos hij ervoor om zich in 1516 aan te sluiten bij de Augustijner broeders in Salamanca, waar hij in 1517 zijn geloften aflegde en in 1518 tot priester werd gewijd.

Hij speelde een belangrijke rol bij het zenden van de eerste Augustijner missionarissen naar de Nieuwe Wereld, met name Mexico, in 1533, en bevorderde zowel de studies als de missies binnen de orde. In 1544, na aanvankelijk het aartsbisdom Granada te hebben geweigerd, werd Thomas voorgedragen als aartsbisschop van Valencia. Hij accepteerde de positie met tegenzin in 1545.

Hij zette programma's op waarbij fondsen van de rijken de armen ondersteunden en hij veranderde zijn eigen huis in een gaarkeuken en opvanghuis, waar hij dagelijks honderden mensen te eten gaf.

Thomas stierf op 8 september 1555 in Valencia op 67-jarige leeftijd aan angina pectoris. Hij werd op 1 november 1658 heilig verklaard door paus Alexander VII. Zijn liturgische feestdag wordt gevierd op 22 september. Sint Thomas van Villanova is de beschermheilige van de Universiteit van Villanova in Pennsylvania, naast andere onderwijsinstellingen en parochies die naar hem vernoemd zijn.