Nato a Fuenllana, in Spagna, nel 1488, Tommaso trascorse la sua infanzia a Villanueva de los Infantes, da cui derivò il suo cognome. I suoi genitori, mugnai, erano noti per le loro azioni caritatevoli, che influenzarono profondamente Tommaso fin da giovane. Seguì un'istruzione superiore all'Università di Alcalá, dove eccelse, conseguendo la laurea in Teologia e diventando un apprezzato professore di filosofia, arti e logica. Nonostante il successo accademico, rifiutò una prestigiosa cattedra all'Università di Salamanca, scegliendo invece di unirsi ai frati agostiniani a Salamanca nel 1516, professando i voti nel 1517 e venendo ordinato sacerdote nel 1518.

Fu determinante per l'invio dei primi missionari agostiniani nel Nuovo Mondo, in particolare in Messico, nel 1533, promuovendo sia gli studi che le missioni all'interno dell'Ordine. Nel 1544, dopo aver inizialmente rifiutato l'arcivescovado di Granada, Tommaso fu nominato arcivescovo di Valencia. Accettò con riluttanza l'incarico nel 1545.

Istituì programmi in cui i fondi dei ricchi avrebbero sostenuto i poveri e trasformò la propria casa in una mensa per i poveri e in un rifugio, dando da mangiare a centinaia di persone al giorno.

Tommaso morì l'8 settembre 1555 a Valencia, all'età di 67 anni, dopo aver sofferto di angina. Fu canonizzato da Papa Alessandro VII il 1° novembre 1658. La sua festa liturgica si celebra il 22 settembre. San Tommaso da Villanova è il patrono dell'Università di Villanova in Pennsylvania, oltre che di altre istituzioni educative e parrocchie intitolate in suo onore.